Kofaktorius – fermento sudėtyje esanti nebaltyminė, mažos molekulinės masės organinė arba neorganinė (metalų jonai) dalis.

Kofaktorius yra būtinas fermento veikimui, t. y. lemia jo aktyvumą.  Daugiau nei 25% visų fermentų, jų veiklai ir pilnam katalizės aktyvumui pasireikšti, reikia metalų jonų. Metalų jonai tiesiogiai dalyvauja katalizėje, o įvairūs organiniai junginiai (pvz., membranų fosfolipidai) – tiesiogiai katalizėje nedalyvauja.

Kofaktoriai dažniausiai jungiasi prie tos baltyminės fermento dalies (vadinamos apofermentu), kuri sudaro aktyvųjį fermento centrą. Kofaktoriai gali ir tvirtai, ir silpnai jungtis su apofermentais. Tvirtai prijungtas kofaktorius yra fermento prostetinė grupė, kurią galima pašalinti tik suardžius fermento erdvinę struktūrą. 

Fermentų kofaktoriai paprastai skirstomi į kofermentus (pvz., NAD⁺, NADP⁺ ir kt.) ir metalų jonus (pvz., Cu²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺), kartais dar yra išskiriama prostetinė fermento grupė. Kai kurie fermentai yra aktyvūs, tik turėdami prijungtą ir kofaktorių, ir kofermentą.

Fermentinės katalizės metu metalų jonai, kaip kofaktoriai, gali atlikti šias funkcijas:

1) poliarizuoti substrato molekulę, todėl lengviau suyra jos cheminiai ryšiai, ir palaikyti substratų pereinamąją būseną;

2) prijungti substratą prie aktyviojo fermento centro;

3) prijungti elektronus iš substrato molekulės ir perduoti juos akceptoriui.

Nors reikia paminėti, kofaktoriais dažnai laikomi tik į fermentų sudėtį įeinantys metalų jonai. (Plč. žr. Kofermentas.)